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質粒提取過程中需要注意的細節
發布時間:2022-03-24   點擊次數:195次

質粒(plasmid) 廣泛存在於生物界,從細菌、放線菌、絲狀真菌、大型真菌、酵母到植物,甚至人類機體中都含有。質粒是細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的DNA分子,存在於細胞質中(但酵母除外,酵母的2 μm質粒存在於細胞核中),具有自主複製能力,使其在子代細胞中也能保持恒定的拷貝數,並表達所攜帶的遺傳信息,是閉合環狀的雙鏈DNA分子。質粒具有自主複製能力,使其在子代細胞中也能保持恒定的拷貝數,並表達所攜帶的遺傳信息。細菌質粒是DNA重組技術中常用的載體。載體是指把一個有用的外源基因通過基因工程手段,送進受體細胞中去進行增殖和表達的工具。將某種目標基因片段重組到質粒中,構成重組基因或重組體。


目前有許多方法用於從細菌中提純質粒 DNA , 這些方法都主要包括有以下 3 個步驟:

1. 細菌培養物的生長。

2. 細菌的收獲和裂解

3. 質粒 DNA 的純化。


(一)細菌培養物的生長

從瓊脂平板上挑取一個單菌落,接種到培養物中 (有含有行當抗生素的液體培養基中生長),然後從中純化質粒,質粒的提純幾乎總是如此。現在使用的許多質粒載體(如 pUC 係列)都能複製到很高的拷貝數,惟致隻要將培養物放在標準 LB 培養基中生長到對數晚期,就可以大量提純質粒。此時,不必造反性地擴增質粒 DNA 。然而,較長一代的載體 (如 pBR322) 由於不能如此自由地複製, 所以需要在得到部分生長的細菌培養物中加入氯黴素繼續培養若幹小時, 以便對質粒進行性擴增。 氯黴素可抑製宿主的蛋白質合成, 結果阻止了細菌染色體的複製, 然而,鬆弛型質粒仍可繼續複製, 在若幹小時內, 其拷貝數持續遞增。 這樣,像 pBR 322-類的質粒,從經氯黴素處理和未經處理的培養物中提取質粒的產量迥然不同,前者大為增高。多年來,加入足以完全抑製蛋白質合成的氯黴素 μg/ml) 已成為標準的操作、用該方法提取的質粒 DNA 量,對於分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。


(二)細菌的收獲和裂解

細菌的收獲可通過離心來進行, 而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種, 這些方法包括用非離子型或離子型去汙劑、 有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。 選擇哪一種方法取決於3個因素:質粒的大小、小腸杆菌菌株及裂解後用於純化質粒 DNA 的技術。

1)大質粒 (大於 15kb) 容易受損, 故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。 將細菌懸於蔗糖等滲溶液中,然後用溶菌酶和 EDTA 進生處理,破壞細胞壁和細胞外膜,再加入 SDS 一類去汙劑溶解球形體。 這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細菌部把質粒釋放出來所需要的作用力。

2)可用更劇烈的方法來分離小質粒。在加入 EDTA 後,有時還在加入溶菌酶後讓細菌

暴露於去汙劑, 通過煮沸或堿處理使之裂解。 這些處理可破壞堿基配對, 故可使宿主的線狀染色體 DNA 變性,但閉環質粒 DNA 鏈由於處於拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當條件恢複正常時,質粒 DNA 鏈迅速得到準確配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。

3)一些大腸杆菌菌株 (如 HB101 的一些變種衍生株 ) 用去汙劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類, 當隨後用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們會惹出麻煩。 糖類會在梯度中緊靠超螺旋質粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的區帶。因此很難避免質粒 DNA 內汙染有糖類,而糖類可抑製多種限製酶的活性。 故從諸 如 HB101 和 TG1 等大腸杆菌蓖株中大量製備質粒時,不宜使用煮沸法。

4)當從表達內切核酸酶 A 的大腸杆菌菌株 (endA+ 株,如 HB101) 中小量製備質粒時,建議不使用煮沸法。 因為煮沸不能完全滅活內切核酸酶 A,以後在溫育 (如用限製酶消化 )時,質粒 DNA 會被降解。但如果通過一個附加步驟 (用酚:氯仿進行抽提 )可以避免此問題。



(三)質粒 DNA 的純化

常使用的所有純化方法都利用了質粒 DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如,用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體 DNA 就取決於溴化乙錠與線狀以及與閉環 DNA 分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與 DNA 結合,進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀 DNA 的長度有所增加,作為補償,將在閉環質粒 DNA 中引入超螺旋單位。最後,超螺旋度大為增加, 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續嵌入。但線狀分子不受此限, 可繼續結合更多的染料, 直至達到飽和 ( 每2個堿基對大約結合1個溴化乙錠分子 ) 。由於染料的結合量有所差別,線狀和閉環 DNA 分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。 多年來, 氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為製備大量質粒 DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費時,為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到極高純度的質粒。


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