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關於外泌體培養的那些事
發布時間:2022-03-29   點擊次數:133次

什麽是外泌體

簡單介紹⼀下細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)。細胞外囊泡是細胞以多種形式分泌到細胞外的各種囊泡:

其主要分為外泌體(Exosomes)直徑為30-150nm,以內吞的形式釋放到細胞外;微囊泡(Microvesicles)直徑為100-1000nm,以出芽的形式釋放到細胞外;凋亡⼩體(Apoptotic body)直徑為50-2000nm,由凋亡細胞產⽣。


生理功能:

外泌體是細胞與細胞間通訊中起關鍵作⽤的胞外基質成分,⼴泛參與細胞間物質運輸與信息傳遞,調控細胞⽣理活動;同時,外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫調節作⽤和誘導正常細胞轉化,促進腫瘤發⽣及轉移的作⽤;此外,外泌體還可以作為“天然的納⽶粒⼦"來進⾏藥物遞送,裝載的藥物類型包括⼩分⼦化學藥物、蛋⽩質和肽、核酸藥物等。


樣本來源:

目前外泌體研究的樣本主要是以細胞培養上清以及各種體液為主,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。


分離手段:

外泌體分離的方式方法有很多很多種,這邊就比較其相對的優劣勢進行簡單的比較:

1.差速超速離⼼:差速超速離⼼是⼤家最熟悉的⼀種分離⽅法,⽂獻中⽤得最多的且也是⽬前⽐較能受到認可的⽅法。差速超速離⼼是先通過低速離⼼去除細胞和細胞凋亡碎⽚,再通過超⾼速去除⼤囊泡和沉澱外泌體。此⽅法分離得到的外泌體可⽤於後續的鑒定實驗、分⼦檢測實驗、細胞實驗和動物實驗。

2.密度梯度離⼼:此⽅法多指蔗糖密度梯度超速離⼼。此⽅法從不同密度的顆粒中分離出囊泡,對離⼼的時間⽐較敏感。如果外泌體和顆粒密度相似,外泌體可能會被其他顆粒汙染。

3.超濾:超濾過程中需要⽤超濾膜進⾏外泌體隔離。在分離過程中,外泌體可能會阻塞過濾孔,導致膜的壽命減短,分離效率較低。同時,外泌體會粘附在膜上,導致產量降低。

4.免疫磁珠法:⽤包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育後結合,即可將外泌體吸附並分離出來。該⽅法分離得到的外泌體的⽣物活性易受pH和鹽濃度影響,不利於下遊實驗。

5.試劑盒分離法:⽬前商業化的外泌體提取試劑盒多種多樣,提取效果良莠不齊。同時試劑盒本⾝的價格⽐較⾼,且外泌體的得率和純度⼀般,不是性價⽐⾼的⼀種分離⽅法。


外泌體的鑒定:

外泌體分離之後,需要經過⼀係列鑒定才能確定分離的是外泌體。。下⾯介紹⼏種鑒定⽅法:

1.透射電鏡鑒定法:透射電鏡,全稱為透射電⼦顯微鏡(Transmission Electron Microscope,簡稱TEM),分辨率為0.1~0.2nm,適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察,⽤於鑒定樣本中是否存在外泌體樣結構,即通常為茶托型或⼀側凹陷的半球形。

2.濃度粒徑檢測法:納⽶顆粒跟蹤分析法,簡稱NTA(Nanoparticle Tracking Analysis),該技術已被外泌體研究領域認可為外泌體表征⼿段之⼀。NTA技術的樣本處理簡單、能保證外泌體原始狀態、檢測速度快,檢測後能提供外泌體粒徑和濃度信息。

3.Western Blot分⼦標誌物檢測: WB可以⽤來鑒定外泌體的標誌蛋⽩是否存在於樣本中。外泌體標誌蛋⽩包括四跨膜蛋⽩家族,如CD9、CD63和CD81;細胞質蛋⽩,如肌動蛋⽩(Actin)和鈣磷脂結合蛋⽩(Annexins);參與⽣物功能的分⼦,如凋亡轉接基因2互作蛋⽩X(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋⽩(TSG101)、熱休克蛋⽩(HSP70、HSP90),以及細胞分泌的特異性蛋⽩。

4.流式細胞術檢測:外泌體可以先進⾏熒光標記,再通過流式細胞儀檢測外泌體表⾯標記蛋⽩。但是傳統的流式細胞儀檢測樣本的顆粒⼤⼩是300-500nm,⽽外泌體直接都在300nm以下,因此,可能⼤量的外泌體檢測不到,造成分析不太準確。

5.ELISA檢測:根據外泌體的表⾯標誌物,如CD9、CD63進⾏ELISA實驗,來檢測外泌體的蛋⽩量,從⽽實現對外泌體的分析。但是ELISA⽅法容易受其他抗原的⼲擾,引起實驗結果出現偏差。


外泌體提取下遊實驗:

1.外泌體microRNA測序/芯⽚:通過對外泌體microRNA的⾼通量分析,可以找到不同外泌體之間差異表達的microRNA,為後續的功能學實驗做準備。

2.外泌體mRNA測序/芯⽚:通過對外泌體轉錄組測序或表達譜芯⽚分析,可以找出不同外泌體之間差異表達的mRNA,從⽽發現外泌體中哪些基因發⽣了變化。

3.外泌體lncRNA芯⽚:通過lncRNA芯⽚可以同時得到lncRNA和mRNA數據,為研究者提供更完整的lncRNA和mRNA篩查。

4.外泌體ceRNA芯⽚:競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)機製如下:microRNA(miRNA)處在調控⽹絡的中⼼,lncRNA分⼦富含miRNA結合位點,可以競爭性地結合miRNA,解除miRNA對其靶基因的抑製作⽤,進⽽調控基因的表達⽔平。通過ceRNA芯⽚可以為研究者提供完整的lncRNA,circRNA和mRNA篩查。

5.外泌體蛋⽩質組學:主要包括iTRAQ蛋⽩質組定量/TMT標記定量蛋⽩質組學/label free蛋⽩質組定量。通過蛋⽩質組學分析,尋找差異表達蛋⽩,並揭⽰其細胞⽣理病理功能。


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