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細胞凋亡檢測技術與方法
發布時間:2022-04-12   點擊次數:97次
具體來說,針對凋亡的不同階段有以下一些方法:  
1.早期檢測:  
1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:  
PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導後不久發生,可能作為免疫係統的識別標誌。AnnexinV,一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白,能專一性的結合暴露在膜外側的PS,再通過簡單的顯色或發光係統進行檢測。由於這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。  
BioVision公司位於美國加州,是世界上專著於凋亡和細胞信號研究的公司。其產品質優、價廉、包裝使用方便。BioVision提供多種標記的AnnexinV產品,並有與核染料PI組成完整早期凋亡檢測試劑盒。  
2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測:  
正常狀態下,穀光苷肽(glutathione:GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩衝劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中,細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移係統。當細胞內GSH的排除非常活躍時,細胞液就由還原環境轉為氧化環境,這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素C(三羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞液中,啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。  
由於GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關,此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外,還可用於心髒病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如:HeLa和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化,不能用此法檢測。  
3)細胞色素C的定位檢測  
細胞色素C作為一種信號物質,在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下,它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中,凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液,結合Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1)後啟動caspase級聯反應:細胞色素C/Apaf-1複合物激活caspase-9,後者再激活caspase-3和其它下遊caspase。  
細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochromecoxidasesubunitⅣ:COX4)是定位在線粒體內膜上的膜蛋白,凋亡發生時,它保留在線粒體內,因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標誌。CytochromecApoptosisAssayKit試劑盒可以有效地檢測凋亡過程中細胞色素c的釋放情況。  
4)線粒體膜電位變化的檢測:  
在凋亡研究的早期,從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機製研究的深入,發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分,發生很多生理生化變化。例如,在受到凋亡誘導後線粒體轉膜電位會發生變化,導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,一個陽離子性的染色劑,對此改變非常敏感,呈現出不同的熒光染色。正常細胞中,它在線粒體中形成聚集體,發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中,因線粒體穿膜電位的改變,它以單體形式存在於細胞液中,發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。Biovision公司的MitoCaptureTMMitochondrialApoptosisDetectionKit(MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測試劑盒)可以簡單、靈敏地體外分析、檢測線粒體在凋亡過程中的變化。  
2.晚期檢測:  
細胞凋亡晚期中,核酸內切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA,產生大量長度在180-200bp的DNA片段。  
1)凋亡DNALadder檢測試劑盒  
細胞經處理後,采用常規方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。QuickApoptoticDNALadderDetectionKit可以快速(約1-2小時)、靈敏地檢測凋亡細胞中的DNA片段。  
2)TUNEL-basedDNA片段分析試劑盒  
細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測。Apo-BrdUTM分析使用2種顏色的TUNEL方法用流式細胞儀檢測凋亡細胞中DNA條帶。采用的BrdU比生物素標記的或(digoxigenylated)標記的方法靈敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一種完整的試劑盒用於雙色的免疫組化(IHC)檢測DNA片段。Apo-DIRECTTM是非常簡單的一步標記凋亡細胞,用於流式細胞術分析。  
3)Caspase分析試劑和試劑盒  
Caspase在細胞凋亡中發揮著重要的作用,屬於天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3為關鍵的執行分子,它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。在正常狀態下,caspase家族都以無活性的酶原(30~50kD)形式表達,Caspase酶原由原結構域、大亞基(~20kD)和小亞基(~10kD)構成。當細胞發生凋亡時caspase可以被蛋白酶裂解,大亞基和小亞基形成活化的caspase。一些caspase活化後可以次序激活其他caspase形成caspase級聯反應,促發細胞凋亡。

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